Qalabka Genotyping Mouse

Bisadda No: HCR2021A

Alaabtan waa qalab loogu talagalay in si degdeg ah loo aqoonsado genotypes jiirka, oo ay ku jiraan soo saarista ceeriin DNA iyo nidaamka kor u qaadida PCR.Alaabta waxaa loo isticmaali karaa kor u qaadida PCR si toos ah dabada jiirka, dhegta, suulasha iyo unugyada kale ka dib markii ay fududeeyeen Lysis Buffer iyo Proteinase k.Ma jiro dheefshiid habeenkii ah, soo saarista phenol-chloroform ama nadiifinta tiirka, taas oo fudud oo soo gaabinaysa wakhtiga qaadashada tijaabooyinka.Alaabtu waxay ku habboon tahay kordhinta jajabyada bartilmaameedka ah ilaa 2kb iyo falcelinta PCR-ga oo leh ilaa 3 lammaane oo aasaasiyaal ah.Isku dhafka 2× Mouse Tissue Direct PCR wuxuu ka kooban yahay DNA polymerase, Mg²⁺, dNTP-yada iyo nidaamka kaydinta la hagaajiyay si loo bixiyo hufnaanta sare u qaadida iyo dulqaadka xannibaadaha, si fal-celinta PCR lagu fuliyo iyada oo lagu darayo template iyo alwaaxyada iyo fuuq-celinta alaabta 1 ×.Alaabta PCR ee lagu xoojiyey alaabtan waxay leedahay saldhig "A" caan ah oo ku yaal dhamaadka 3′ waxaana si toos ah loogu isticmaali karaa cloning TA ka dib nadiifinta.

Qaybaha

Xaaladaha Kaydinta

Alaabta waa in lagu kaydiyaa at -25 ~ -15 ℃ 2 sano.Ka dib dhalaalidda, Lysis Buffer waxaa lagu kaydin karaa 2 ~ 8 ℃ isticmaalka muddada gaaban ee isticmaalka badan, oo si fiican u walaaq marka la isticmaalayo.

Codsiga

Alaabtani waxay ku habboon tahay falanqaynta garaaca jiirka, ogaanshaha transgenic, genotyping iyo wixii la mid ah.

Astaamaha

1.Qalliin fudud: looma baahna in la soo saaro DNA-da genomic;

2.Codsiga ballaaran: ku habboon kor u qaadista tooska ah ee unugyada jiirka ee kala duwan.

Tilmaamaha

1.Sii deynta genomic DNA

1) Diyaarinta lysate

Tissue lysate waxaa loo diyaariyaa iyadoo loo eegayo tirada muunada jiirka ee la lysed (unugyada lysate waa in lagu diyaariyaa goobta iyadoo loo eegayo qiyaasta iyo si fiican loogu qaso isticmaalka), iyo saamiga reagents ee looga baahan yahay hal muunad waa sida soo socota:

2) Diyaarinta Tusaalaha iyo Lysis

Isticmaalka Nudaha lagu taliyay

Qaado cadad muunad muunado unug muus ah tuubooyinka centrifuge nadiif ah, ku dar 200μL oo ah unug lysate unug cusub tuubo centrifuge kasta, vortex iyo rux, ka dibna ku dhufo at 55 ℃ 30mins, ka dibna kulayl 98 ℃ 3mins.

3) Bahda dhexe

Si fiican u rux lysate-ka oo ku dabool 12,000 rpm 5mins.Mashiinka sare waxa loo isticmaali karaa qaab tusaale ahaan kor u qaadida PCR.Haddii qaab-dhismeedka loo baahan yahay kaydinta, ku wareeji supernatant tuubo kale oo centrifuge ah oo nadiif ah oo ku kaydi -20℃ ilaa 2 toddobaad.

2.Kordhinta PCR

Ka saar 2× Mouse Tissue Direct PCR Mix ka -20 ℃ oo ku dhalaali barafka, isku qas oo kor u diyaari nidaamka falcelinta PCR sida ku cad shaxda soo socota (ku shaqee barafka):

Fiiro gaar ah:

a) Qadarka lagu daray waa inuusan ka badnaan 1/10 ee nidaamka, iyo haddii wax badan lagu daro, kordhinta PCR waa la joojin karaa.

Shuruudaha PCR ee lagu taliyay

Fiiro gaar ah:

a) Heerkulka Annealing: Iyadoo la tixraacayo qiimaha Tm ee furaha, waxaa lagu talinayaa in la dejiyo heerkulka annealing qiimaha Tm yar ee Primer +3 ~ 5℃.

Dhibaatooyinka iyo Xalka Caadiga ah

1.Ma jiraan xadhig la beegsaday

1) Wax soo saarka lysis xad-dhaaf ah.Dooro tirada ugu habboon ee template, badiyaa aan ka badnayn 1/10 ee nidaamka;

2) Cabbir muunad oo aad u weyn.Walaaq lysate 10 jeer ka dibna kordhi, ama yaree cabbirka muunadda oo dib-u-lysis;

3) Tijaabooyin unuggu ma cusba.Waxaa lagu talinayaa in la isticmaalo muunado unug cusub;

4) Tayada asaasiga ah oo liidata.Isticmaal DNA-da genomic si aad u kordhiso si aad u xaqiijiso tayada asaasiga ah oo aad u wanaajiso naqshadda asaasiga ah.

2.Kordhinta aan gaarka ahayn

1) Heerkulka annealing aad buu u hooseeyaa lambarka wareegguna aad buu u sarreeyaa.Kordhi heerkulka annealing oo yareeyo tirada wareegyada;

2) Samaynta qaab-dhismeedku aad buu u sarreeyaa.Yaree tirada templateka ama ku milo qaabka 10 jeer ka dib kordhinta;

3) Tilmaamaha asaasiga ah oo liita.Wanaaji naqshadda asaasiga ah.

Xusuusin

1.Si looga fogaado wasakhaynta isdhaafka ah ee u dhaxaysa shaybaarada, waa in la diyaariyaa qalab muunado badan, iyo dusha qalabka waxa lagu nadiifin karaa 2% sodium hypochlorite ama nadiifiyaha nucleic acid ka dib muunad kasta haddii loo baahdo isticmaalka soo noqnoqda.

2.Waxaa lagu talinayaa in la isticmaalo unugyo cusub oo jiirka ah, mugga muunadduna waa in aanu aad u weynayn si looga fogaado in ay saamayn ku yeelato natiijooyinka kor u qaadida.

3.Lysis Buffer waa in ay ka fogaato baraf-dhalaalid joogto ah, waxaana lagu kaydin karaa 2 ~ 8 ℃ isticmaalka badan ee muddada gaaban.Haddii lagu kaydiyo heerkul hooseeya, roobab ayaa dhici kara, waana in si buuxda loo milmaa ka hor isticmaalka.

4.Isku-dhafka PCR waa inuu ka fogaadaa baraf-dhalaalid oo joogto ah, waxaana lagu kaydin karaa 4 ℃ isticmaalka soo noqnoqda ee muddada gaaban.

5.Alaabtan waxa loogu talagalay oo keliya cilmi-baadhis tijaabo ah oo cilmi ah oo waa inaan loo isticmaalin ogaanshaha ama daawaynta.